Biotratamento para Redução do Teor de Lipídeos Presentes em Efluentes das Indústrias de Produtos Lácteos

Adriano A. Mendes^*, Heizir F. de Castro

Laboratório de Biocatálise, Departamento de Engenharia Química

Faculdade de Engenharia Química de Lorena, Caixa Postal 116, 12.606-970, Lorena-SP

*E-mail: adriano.a.mendes@dequi.faenquil.br

Resumo: Preparações de lipases de procedência nacional (pancreatina Kin Master-LKM) e importada (pancreática Sigma, Tipo II-LPP) foram utilizadas na hidrólise de óleos e gorduras presentes em soro de queijo. Diferentes condições experimentais foram testadas para verificar  a influência da concentração do agente emulsificante, íons cálcio e ajuste de pH na formação de ácidos graxos. As preparações enzimáticas apresentaram desempenhos bastante similares com formação máxima de ácidos graxos nos tratamentos efetuados numa concentração enzimática de 3 mg/mL, adição de agente emulsificante 3% p/v, ajuste de pH do meio reacional com solução NaOH 1M e ausência de íons cálcio. Nas amostras tratadas enzimaticamente foram ainda determinados os teores de interesse do processo, incluindo: demanda química de oxigênio, teores de proteína e glicerol. A preparação enzimática disponível no mercado nacional ofereceu melhor custo/benefício.

Palavras chave: lipases, efluentes, produtos lácteos, tratamento enzimático, hidrólise.

1. INTRODUÇÃO

           

      Os laticínios representam um importante setor da indústria alimentícia, tanto do ponto de vista econômico quanto social. Entretanto, considerando o grande número de empresas que lançam seus efluentes sem nenhum tipo de tratamento nos cursos d’água, a contribuição dessas indústrias, em termos de poluição hídrica, principalmente com relação à carga orgânica, é bastante significativa. O problema agrava-se se for considerado que 90% dos laticínios, em funcionamento, são de pequeno e médio portes, não possuindo quadro qualificado para lidar com as mudanças necessárias à implementação de tecnologias limpas e com a operação de sistemas de tratamento de efluentes.

      O efluente gerado, pelos laticínios, na manufatura de leite, contém uma Demanda Química de Oxigênio (DQO) em torno de 3000 mg/L. Em setores, onde há uma grande produção de queijos e derivados, o valor de DQO é superior a 50000 mg/L (Gavala et al., 1999). Desse montante, o teor de lipídeos é superior a 100 mg/L (Hwu et al., 1998). A acumulação, desses compostos, causa problema na digestão anaeróbia de efluentes, como toxicidade a microorganismos acetogênicos e metanogênicos (Hanaki et al., 1981), formação de espumas, devido ao acúmulo de ácidos graxos não biodegradados (Salminen e Rintala, 2002) e decréscimo da concentração de trifosfato de adenosina (ATP) (Hanaki et al., 1981; Perle et al., 1995).

Os lipídeos impedem a adsorção de ácidos graxos na superfície celular causando flotação da biomassa e impedindo a formação de grânulos de lodo em reatores anaeróbios do tipo UASB (Gavala et al., 1999; Hwu et al., 1998). A flotação do lodo é decorrente da dificuldade de liberação de gases produzidos na digestão anaeróbia (Petruy e Lettinga, 1997). A biodegradação de óleos e gorduras, em compostos mais simples, consiste em utilizar lipases para promover a reação de hidrólise por via seqüencial dos grupos acila no glicerídeo  (Haraldsson, 1991). 

Lipases (triacilglicerol acil hidrolases, E.C.3.1.1.3) compreendem um grupo de enzimas hidrolíticas que atuam na interface orgânica-aquosa, catalisando a hidrólise de ligações éster-carboxílicas, presentes em acilgliceróis e podendo a reação inversa (síntese) ocorrer em ambientes pobres em água (Saxena et al., 2003). As lipases podem ser classificadas como régio-específicas e não específicas, ambas de grande interesse para o tratamento de efluentes com alto teor de lipídeos (Saxena et al., 2003). As lipases específicas hidrolisam ácidos graxos específicos, como é o caso das lipases de fonte animal que hidrolisam ácidos graxos na posição 1,3 (Benzonana e Desnuelle, 1965). Esse tipo de tratamento apresenta algumas vantagens, tais como a especificidade que permite controlar os produtos, o que leva a um aumento dos rendimentos pela não-geração de subprodutos tóxicos, condições moderadas de operação, redução do custo em termos de energia e de equipamentos tornando este processo atrativo sob o ponto de vista ambiental (Masse et al., 2001).

      A digestão anaeróbia destes rejeitos é um processo lento, tendo como etapa limitante à liberação de ácidos graxos pelos microrganismos específicos com atividade lipolítica (Perle et al., 1995). A utilização de um pré-tratamento enzimático mostra ser uma técnica bastante promissora na redução do tempo de retenção hidráulica, deste efluente, em lagoas de estabilização (Leal et al., 2002).

       O principal objetivo deste trabalho foi estudar a redução do teor de gordura de efluentes de indústrias de produtos lácteos tratados com preparações de lipases pancreáticas de procedência nacional, lipase LKM e estrangeira, lipase LPP. O soro de queijo foi usado como substrato representativo para determinar a influência das variáveis na hidrólise dos lipídeos presentes em efluentes de indústria de produtos lácteos.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Materiais

Foram utilizadas preparações de lipases comerciais de origem animal, pancreática  (Tipo II) adquirida da empresa Sigma Co (EUA) e pancreatina 6NF gentilmente fornecida pela empresa Kin Master (RS). O substrato utilizado, como efluente, foi o soro de leite gerado na produção de queijo tipo Minas no Laboratório de Biocatálise/ FAENQUIL. O soro foi guardado em recipientes de plásticos de 1,5 litros limpos não esterilizados e armazenados em freezer a 0°C, para conservação das suas características. Todos os reagentes empregados foram de grau analítico.

2.2.Testes de Hidrólise com as Preparações de Lipase

            O método consistiu no monitoramento da reação de hidrólise, medindo-se a produção de ácidos graxos, em intervalos de tempo definidos, num período total de 24 h. Parâmetros reacionais, tais como pH e temperatura foram fixados tomando por base resultados anteriormente obtidos referentes a caracterização bioquímica dessas preparações enzimáticas (Gomes et al., 2002). O substrato foi preparado pela adição direta do agente emulsificante ao efluente bruto. Em balões de fundo redondo de 125 mL foram adicionados emulsões preparadas com 50 g do efluente, massas apropriadas de goma arábica (3-7% m/v) e íons cálcio (0-0,11 g). O pH do meio reacional foi ajustado pela adição de solução de NaOH 1M ou NaHCO₃, para manter as condições operacionais mais próximas daquelas encontradas industrialmente, conforme mostrado na Tabela 1. Com exceção dos experimentos 5 A, B (controle) sem adição de solução enzimática, todos os tratamentos foram efetuados empregando uma concentração de enzima de 3 mg/mL.

Os balões foram incubados por um período máximo de 24 horas numa temperatura de 40°C, em banho de silicone, com agitação magnética (600 rpm). Periodicamente foram retiradas amostras de 2 g do meio reacional e o teor de ácido graxo quantificado por titulação com KOH 0,02 N. O ensaio com maior formação de ácidos graxos, foram determinadas os teores de glicerol, proteína e Demanda Química de Oxigênio (DQO).

Tabela 1. Ensaios da hidrólise do efluente empregando as preparações enzimáticas.

LKM	LPP	[E] (%)	Goma (%)	CaCl2 (g)	Ajuste de pH
1 A	1 B	0,3	3	0	Ausente
2 A	2 B	0,3	3	0	Presente1
3 A	3 B	0,3	7	0	Ausente
4 A	4 B	0,3	7	0	Presente2
5 A	5 B	0	7	0	Presente2
6 A	6 B	0,3	7	0	Presente1
7 A	7 B	0,3	3	0,11	Ausente
8 A	8 B	0,3	7	0,11	Presente1

LKM- Lipase pancreatina Kin Master

LPP- Lipase pancreática Sigma

1-Ajuste de pH com solução NaOH 1M

2-Ajuste de pH com NaHCO₃

2.3. Análises

O teor de sólidos totais foi determinado por evaporação do efluente com o auxílio de um rotoevaporador. O índice de acidez, índice de saponificação e porcentagem de ácidos graxos livres foram determinados segundo metodologia descrita por Moretto e Fett (1998). O pH foi determinado com o auxílio do pHmetro. Densidade foi determinada com o auxílio de um picnômetro. A demanda química de oxigênio (DQO) foi determinada pelo método descrito por APHA (1992). O teor de proteínas foi determinado pelo método de Bradford (Bradford, 1976). A concentração de glicerol foi determinada segundo metodologia descrita por Cocks e Van Rede (1966). A concentração de ácidos graxos formados foi calculada pela equação1.

onde: M_KOH= Concentração Molar da solução de KOH; V_KOH= Volume gasto de KOH na titulação (mL); Va= Volume da amostra (mL)

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Caracterização do efluente

            O soro do leite, utilizado como efluente das indústrias de derivados lácteos, foi caracterizado conforme resultados mostrados na Tabela 2.

Tabela 2: Parâmetros de caracterização do soro de leite

.

Parâmetros	Resultados
Sólidos Totais (g/L)	7,53
Índice de Acidez	1,33
Índice de Saponificação	60,2
pH	6,41
Densidade (g/cm3)	1,02
Ácidos Graxos Livres (%)	0,63
Proteínas (mg/mL)	1,43
Glicerol (%)	2,79

3.2. Efluente Tratado com Lipases

            As Figuras 1 e 2 mostram a concentração de ácidos graxos formados pela hidrólise do efluente por meio das lipases pancreáticas LKM (Kin Master) e LPP (Sigma) após 24 h de tratamento. Para ambas preparações (numa concentração de 3mg/mL) a maior porcentagem de hidrólise de óleos e gorduras presentes no efluente foram obtidas nas seguintes condições experimentais: 3% (m/v) de agente emulsificante, ajuste de pH com solução de NaOH 1M e ausência de íons cálcio (ensaios 2 A, B). Os experimentos realizados com ajuste de pH com NaHCO₃ (4 A, B e 5 A, B), não apresentaram resultados satisfatórios. O pH do meio reacional elevou-se rapidamente a valores superiores a 9,0, afastando do pH ótimo de atuação das preparações enzimáticas (LPP=7,5 e LKM=8,0), reduzindo significativamente a atividade lipolítica das lipases. A quantidade de ácido graxo eventualmente formado pela hidrólise enzimática foi similar ao do controle, sendo computado ao final do tratamento enzimático concentrações de ácidos graxos próximos a zero. Para detectar possíveis influências do substrato (soro) ou NaHCO₃, foi realizada a hidrólise do azeite de oliva a 20% (v/v) com concentração de goma arábica a 3% (m/v) empregando a preparação enzimática LKM. Os resultados obtidos, mostraram pequena variação na formação de ácidos graxos. O pH do meio reacional aumentou até 8,4, não alterando significativamente o pH do ótimo da enzima. Esses dados sugerem que compostos presentes no soro podem reagir com o NaHCO₃, influenciando negativamente a atividade lipolítica da lipase. Estudos serão realizados para detectar possíveis compostos que possam inibir a atividade enzimática.

Figura 1. Hidrólise do efluente pela lipase LKM.	Figura 2. Hidrólise do efluente pela lipase LPP.

LKM- Lipase pancreatina Kin Master

LPP- Lipase pancreática Sigma

            Como esperado, o aumento da concentração de agente emulsificante de 3% m/v (ensaios 2 A, B) para 7%p/v (ensaios 6 A, B), não correspondeu a aumentos significativos de porcentagem de hidrólise. Agentes emulsificantes têm sido sistematicamente empregados em dosagens de atividade lipolítica quando se utilizam triacilgliceróis de cadeia longa como substratos. Considera-se,  geralmente, que os agentes emulsificantes, especialmente a goma arábica, não interferem nos ensaios de hidrólise de lipídeos pela ação das lipases. Tiss et al. (2002) observaram um efeito de inibição da goma arábica na hidrólise de ésteres trioctanóicos, com a utilização de lipases de fontes microbiana e animal. Esses autores sugeriram que compostos tensoativos presentes nas formulações de goma arábica podem ser responsáveis pelo efeito de inibição em lipases. Essa inibição pode ser associada ao efeito de dessorção da lipase na interface água/óleo, pois a goma arábica consiste, principalmente, de cadeia de polissacarídeos, incluindo unidades de ácido glicurônico (Whistler, 1993). Na sua forma ionisada, os grupos carboxil do ácido glicurônico estão desprotonados e, conseqüentemente, conferem à interface da emulsão uma carga global negativa. A repulsão eletrostática de lipases de pâncreas na interface por cargas negativas dos sais de bílis, presentes nessas preparações, é um outro mecanismo de inibição de lipases (Borgström, 1975). Goma arábica contém, em sua composição, açúcares (D-galactose, L-arabinose, ácido D-glicurônico) e 2% de proteínas (prolina, hidroxiprolina e serina) (Tiss et al., 2002).

            O efeito dos íons cálcio na atividade de lipases é considerado benéfico, sendo capaz de alterar a conformação da enzima, ou seja, íons cálcio agem como co-fator da lipase promovendo um aumento de sua atividade catalítica (Sharma et al., 2001). É sugerido que o cálcio reduz a acidez livre produzida durante a hidrólise pela formação de sabão de cálcio insolúvel, permitindo o prosseguimento da reação hidrolítica. A necessidade do cálcio, na presença de sais biliares e´, provavelmente, para compensar a repulsão eletrostática criada entre a enzima e grupos carboxílicos dos sais biliares (Shahani, 1975). A influência da suplementação de substratos com CaCl₂ (ensaios 8A, B) na formação de ácidos graxos pela hidrólise enzimática foi pouco significativa, provavelmente devido a presença de íons cálcio no meio reacional, tornando desnecessário a sua utilização no meio reacional. Algumas fontes prováveis de íons cálcio incluem: o próprio efluente (efluentes de indústrias de derivados lácteos são ricos em íons cálcio) e goma arábica, cuja formulação contém diversos íons, tais como cálcio, magnésio e potássio.

3.3. Caracterização do Efluente Tratado com as Preparações de Lipases

            Nas amostras de efluentes, tratadas enzimaticamente nas condições empregadas nos ensaios 2 A,B por 24 h, foram também determinadas as concentrações de glicerol, proteína e DQO.

            Com relação a concentração de glicerol formado foi verificado um aumento pouco significativo, em relação às concentrações iniciais. Este fato pode ser relacionado com a fonte de lipase utilizada (pancreática). As lipases, de fonte animal, são lipases 1,3 específicas que hidrolisam, preferencialmente, ácidos graxos nas posições 1 e 3 nas moléculas de triacilgliceróis, podendo levar ao acumulo de concentrações significativas de monoacilgliceróis no meio reacional (Benzonana e Desnuelle, 1965). Por outro lado, a composição dessas preparações de lipases pode conter também esterases, as quais hidrolisam os monoacilgliceróis, liberando glicerol e uma molécula de ácido graxo. Verifica-se na Tabela 3, que a concentração de glicerol formado pela lipase LPP foi similar a obtida pela lipase LKM, o que está de acordo com as concentrações de ácidos graxos formados por essas preparações enzimáticas. 

Tabela 3: Parâmetros de caracterização do efluente tratado com as preparações de lipases.

Lipases	Glicerol (%)		Ácidos Graxos  (mM/mL)		Proteína (mg/mL)		DQO (mg/L)
	0 h	24 h	0 h	24 h	0 h	24 h	0 h	24 h
LKM	2,74	3,55	23,5	69,5	3,15	0,30	113.000	110.000
LPP	2,76	3,59	20,5	71,4	2,40	0,20	113.000	111.000

LKM- Lipase pancreatina Kin Master

LPP- Lipase pancreática Sigma

Com relação ao teor de proteínas, a lipase LKM, adquirida no mercado nacional apresentou uma maior redução quando comparada com a lipase LPP, de procedência internacional, devido provavelmente a elevada atividade de protease contida nessa preparação (Boletim Informativo Kin Master, 2000), degradando mais facilmente os componentes orgânicos proteicos presentes no efluente. 

Lipases pancreáticas têm uma massa molecular de aproximadamente 50KDa e são normalmente isoladas de pâncreas ou biles de animais (porco). Por esta razão, são preparações geralmente impuras, contendo outras hidrolases, como esterases, tripsina, proteases, entre outras (Kazlauskas e Bornscheuer, 1998). As enzimas de fabricação nacional apresentam um limitado grau de pureza, o que diminui o seu custo e não interfere no processo, tendo em vista que na degradação dos lipídeos presentes em efluentes não é requerido um elevado grau de hidrólise (maior que 90%). Além disso, a presença de outras enzimas contaminantes (proteases, amilases) é benéfica ao processo, tendo em vista que os efluentes das indústrias de derivados lácteos contem, além de gorduras, altos teores de proteínas provenientes do leite (caseína) e carboidratos como amido, utilizado na preparação de doces à base de leite e iogurtes.

            A redução do teor de DQO foi pouco significativa, com o tratamento enzimático, devido a alta concentração de lipídeos, presente no efluente utilizado. Elevadas concentrações de lipídeos (0,8 a 1,2 g/L) diminui a eficiência de remoção de DQO (Leal et al., 2002). Apesar da pequena redução de DQO constatada, o tratamento enzimático foi bastante satisfatório, promovendo a hidrólise de lipídeos e proteínas presentes no efluente testado neste trabalho. Testes de biodegradabilidade serão ainda realizados para avaliar o impacto do tratamento enzimático no  tempo de permanência do efluente nas lagoas de estabilização anaeróbias. Ressalta-se que o custo da lipase pancreatina (LKM) é 5 vezes inferior ao preço praticado no mercado da distribuição da lipase fornecida pela empresa Sigma (LPP). 

4. CONCLUSÕES

            A formação de ácidos graxos foi favorecida para efluentes emulsificados com goma arábica (3% p/v), com pH ajustado com solução NaOH 1M e na ausência de CaCl₂. Apesar dos graus de pureza diferentes, as preparações de lipases LKM e LPP demonstraram desempenhos similares quando usadas na concentração de 3mg/mL. Ambas enzimas hidrolisaram eficientemente os lipídeos e proteínas existentes no efluente, entretanto a concentração de matéria orgânica presente no efluente não foi significativamente reduzida, provavelmente devido ao alto teor de lipídeos no soro de leite. Considerando que a hidrólise de lipídeos é a etapa determinante na digestão anaeróbia, o tratamento proposto poderá auxiliar na redução do tempo de retenção hidráulica nas estações de tratamento de efluentes. A lipase disponível no mercado nacional ofereceu o melhor custo/benefício, sendo selecionada para realização de experimentos subseqüentes para avaliação do impacto do tratamento enzimático nesses efluentes, por meio de testes de biodegradabilidade.

Agradecimentos: Ao Prof. Dr. Ismael Maciel Mancilha pela obtenção do soro, utilizado como efluente referencial das indústrias de derivados lácteos, a empresa Kin Master pela doação da amostra da lipase pancreatina e ao programa CT-Hidro CNPq, pelo suporte financeiro.