Hidrólise Enzimática do Efluente proveniente de Frigorífico Avícola utilizando Lipase 

Ernandes Benedito Pereira¹, Heizir Ferreira de Castro², Agenor Furigo Junior¹

¹Universidade Federal de Santa Catarina – Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos-Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis-SC, E-mail: ernandes@enq.ufsc.br

²Faculdade de Engenharia Química de Lorena – Departamento de Engenharia Química

Laboratório de Biocatálise, Caixa Postal 116, 12600-970, Lorena/ SP.

Estudos anteriores operando com efluentes gerados em frigoríficos avícolas e lipase microbiana de Candida rugosa indicaram que porcentagens de hidrólise mais elevadas foram alcançadas em efluentes tamponados no pH ótimo de atuação dessa preparação enzimática (solução tampão de fosfato de sódio 0,1M; pH 7,0). Para verificar a influência das variáveis:  concentração de enzima, agente emulsificante e íons cálcio no desempenho da hidrólise dos lipídeos foi proposto um planejamento fatorial completo 2³, considerando como variável resposta porcentagem de hidrólise após 3 horas de tratamento. Os resultados obtidos indicam uma influencia significativa da concentração da enzima e do agente emulsificante, independente da concentração de íons cálcio. A hidrólise foi maximizada (20,87%) empregando uma concentração de 0,4% m/v de enzima e 3% m/v do agente emulsificante. O ajuste do pH do efluente pela adição de NaOH ou NaHCO₃ em substituição a solução tampão e após 12 horas de tratamento elevou a porcentagem de hidrólise dos lipídeos para 35%.

INTRODUÇÃO

Nas duas últimas décadas inúmeros melhoramentos no processo anaeróbio de efluentes de indústrias alimentícias têm sido realizados, principalmente para tratamento de águas residuárias da produção de açúcar, amido e cerveja (Hu et. al., 2001). Entretanto, para alguns efluentes contendo elevados teores de óleos e gorduras, como os provenientes de frigoríficos, abatedouros, laticínios, enlatados, entre outros, a operação de reatores de digestão anaeróbia apresenta inúmeros problemas operacionais como formação de escuma pelas camadas de lipídeos, formação de caminhos preferenciais no leito de lodo e arraste da biomassa, levando a perda da eficiência e até mesmo ao colapso do reator (Leal, 2000; Hu et al., 2001). Os reatores anaeróbios situados à jusante de unidades fabris são, portanto, suscetíveis à alimentação de efluentes com teores de gordura acima dos recomendáveis. No caso específico dos reatores UASB recomenda-se um teor de gordura no efluente não ultrapasse valores da ordem de 150 mg/L (Leal, 2000).

Técnicas para melhorar a eficiência dos biodigestores, incluem instalação de caixas de gordura ou flotadores, tratamentos com adição de álcalis ou enzimas específicas como as hidrolases, principalmente as lipases (glicerol éster hidrolases, EC 3.1.1.3) cuja função biológica é a hidrólise de ligações éster carboxílicas presentes em acilgliceróis com conseqüente liberação de ácidos graxos e glicerol. As lipases apresentam uma importância particular, pelo fato de hidrolisarem especificamente os óleos e gorduras, o que pode ser de grande interesse para o tratamento de efluentes com alto teor de lipídeos. Esse tipo de tratamento apresenta algumas vantagens, tais como a especificidade que permite controlar os produtos, o que leva a um aumento dos rendimentos pela não-geração de subprodutos tóxicos; condições moderadas de operação, redução do custo em termos de energia e de equipamentos tornando este processo atrativo sob o ponto de vista ambiental (Masse et al., 2001).

            Estudos anteriores (Pereira et al., 2002) operando com efluentes gerados em frigoríficos avícolas e lipase microbiana de Candida rugosa revelaram porcentagens de hidrólise mais elevadas em meios reacionais ajustados ao pH ótimo de atuação dessa preparação enzimática, (tampão fosfato 0,1M, pH 7,0). Tomando por base esses resultados e considerando as inúmeras variáveis envolvidas nesse procedimento, optou-se pelo uso da ferramenta do planejamento experimental para determinar as condições ótimas na hidrólise para remoção de gorduras dos resíduos gerados pela indústria de abate de frango pela preparação comercial de lipase de Candida rugosa.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Materiais

Todos os experimentos foram realizados com uma preparação de lipase microbiana (Candida rugosa) disponível comercialmente (tipo VII, Sigma Co, EUA) com atividade lipolitíca de 1830 U/ mg (Pereira et al., 2002). O efluente foi obtido da indústria frigorífica de abate de frango (Indústria Macedo Koerich, Florianópolis/ SC) e coletado em um único ponto antes de ser conduzido à Estação de Tratamento (Entrada do Flotador). O efluente foi guardado em recipientes de plásticos de 5 L limpo não esterilizado e armazenado em freezer a 0ºC, para conservação das suas características até sua efetiva utilização.

2.2. Métodos Analíticos

O efluente foi caracterizado segundo normas recomendas por métodos oficiais (Standard Methods, 1995). O teor de óleos e graxas foi determinado por extração em Soxhlet com hexano como solvente. A concentração de ácido graxo livre foi determinada por titulação de alíquotas dissolvidas em 10 mL de etanol p.a, empregando-se solução alcoólica de KOH 0,02N. A demanda química de oxigênio (DQO) foi medida pelo Método Colorimétrico de Refluxo Fechado (Hach). A alcalinidade foi medida sem uma separação dos sólidos em suspensão, titulando-se a amostra com ácido sulfúrico 0,02 N até pH = 3,7. A acidez foi determinada por via titulométrica, utilizando-se solução de NaOH 0,1 N, necessários para neutralizar os ácidos livres de uma grama da amostra. O resultado foi expresso em porcentagem de ácido graxo livre. O índice de saponificação foi calculado a partir da composição em ácidos graxos, em função da definição do índice, que corresponde ao número de miligramas de hidróxido de potássio necessário para neutralizar os ácidos graxos resultantes da hidrólise de 1 g da amostra, e é inversamente proporcional ao peso molecular dos ácidos graxos dos glicerídeos presentes (Moretto  et al., 1998).

2.3. Delineamento Experimental

            Para verificar a influência das variáveis: concentração de enzima (x₁), do agente emulsificante (x₂) e íons cálcio (x₃) na porcentagem de hidrólise enzimática do efluente foi adotada a metodologia do planejamento experimental empregando uma matriz 2³. Foram realizados ensaios adicionais no ponto central para estimar o erro experimental. A variável resposta considerada foi a porcentagem de hidrólise. Os níveis utilizados na matriz foram selecionados com base nos resultados obtidos anteriormente (Pereira et al., 2002), conforme mostrado na Tabela 1. A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando-se o programa STATISTICA versão 6.0.

Tabela 1. Níveis das variáveis utilizados no planejamento fatorial completo 2³

Variáveis	Níveis
	Mínimo (-)	Médio (0)	Máximo (+)
Concentração de lipase [E]  (% m/v)	0,1	0,25	0,4
Concentração de agente emulsificante [AE]  (% m/v)	0	1,5	3
Concentração de CaCl2 (M)	0	0,01	0,02

As hidrólises foram realizadas em frascos de 250 mL contendo 100 gramas de efluente, 40 mL de solução tampão de fosfato de sódio (0,1M, pH 7,0) e quantidades apropriadas de enzima, agente emulsificante (goma arábica) e cloreto de cálcio. Os frascos foram incubados por um período máximo de 6 horas numa temperatura de 40°C, com agitação magnética (200 rpm). Periodicamente foram retiradas amostras e quantificados os teores de ácido graxo por titulação com KOH 0,02N usando fenolftaleína como indicador. A porcentagem de hidrólise foi calculada pela determinação da concentração de ácidos graxos formado durante a reação de hidrólise dos triglicerídeos presente no substrato, de  acordo com  a equação 1 (Rooney et al., 2001). 

                  (1)

onde: V_KOH = volume de KOH da amostra (mL);  N_KOH= normalidade do KOH (0,02 N); MM= massa molecular média dos ácidos graxos no efluente (318,3); m= massa da amostra; f = fração de óleo e graxas (48,3 g/L).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Caracterização Química do Efluente

            A composição química de um determinado efluente pode variar de acordo com a hora da coleta, estação do ano, lavagem, entre outros. Em efluentes provenientes de frigoríficos de abate de frangos, além de lipídeos, vários outros componentes, provenientes do processo industrial de escaldagem e depenagem, da lavagem do frango, das vísceras, dos equipamentos, dos pisos e outros, podem estar presentes, tais como amônia e fosfato.    

Na Tabela 2 encontram-se alguns dos compostos presentes no efluente usado nesse estudo. Os valores encontrados para os diversos componentes analisados, indicam que a composição química está dentro dos limites de variação esperada. O valor encontrado para o índice de saponificação (IS = 188,60 mg KOH/g) é similar aos valores normalmente encontrados nos óleos origem animal (160-193). O índice de saponificação comprova a presença de composto insaturado, sendo de extrema importância no cálculo da massa molecular média dos ácidos graxos do efluente. A massa molecular do efluente determinada foi de MM=318,3 g/mol. O índice de acidez de 3% está acima do valor esperado dos óleos em geral, os quais devem apresentar valores máximos de acidez de 1,5%. Observa-se ainda que o efluente apresenta uma alta carga orgânica expressa em termos de demanda química de oxigênio (39296 ppm), fato normalmente verificado em efluentes com elevados teores de gorduras.

Tabela 2. Composição química do efluente

Análise	Resultado
pH	6,2
Acidez (%)	3,0
Alcalinidade (mg CaCO3/L)	75,1
DQO (mg/L)	3.930
Amônia (mg/L)	17,4
Fósforo total (mg/L)	7,30
Fosfato total (mg/L)	80,70
Índice de saponificação (mg KOH/g)	188,6
Massa molecular (aproximada) (g/mol)	318,3
Óleos e graxas (g/L)	48,3
Massa específica (g/mL)	0,92
Ácidos graxos livres (%)	53,6
Ácido oléico (%)	14,4

3.2. Hidrólise Enzimática

            Na Tabela 3 encontram-se os resultados obtidos nos ensaios realizados com base no planejamento fatorial 2³, para avaliação das variáveis: concentração de lipase (x₁), agente emulsificante (x₂) e íons cálcio (x₃) na formação de ácidos graxos (mM) e porcentagem de hidrólise alcançada após 3 h de tratamento enzimático.

Tabela 3 – Matriz do planejamento fatorial completo 2³ para a lipase de Candida rugosa

Ensaio	Valores reais				Resposta
	[E] %	[AE]  %	[CaCl2] M	Hidrólise (%)		Ácidos graxos formados (mM)
1	0,1	0	0	8,1		10,0
2	0,4	0	0	16,1		20,0
3	0,1	3	0	13,7		17,0
4	0,4	3	0	19,4		21,0
5	0,1	0	0,02	7,3		9,0
6	0,4	0	0,02	10,5		13,0
7	0,1	3	0,02	16,1		15,0
8	0,4	3	0,02	22,6		28,0
9	0,25	1,5	0,01	12,9		16,0
10	0,25	1,5	0,01	14,5		18,0
11	0,25	1,5	0,01	11,3		14,0

A liberação de ácidos graxos variou entre 10 mM a 28 mM, correspondendo a porcentagens de hidrólise entre 8,1 a 22,6%. Verifica-se que a formação de ácidos graxos foi dependente da concentração de lipase e do agente emulsificante. A suplementação de íons cálcio no meio reacional não apresentou efeito significativo, provavelmente devido à presença de cálcio na goma arábica, tornando desnecessário o uso de CaCl₂. De uma maneira geral, a reação de hidrólise foi favorecida para meios reacionais emulsificados com goma arábica e concentração de lipase nos níveis máximos. 

Na Tabela 4 reúne os dados da análise dos efeitos, erros-padrão e do teste t de Student’s. Verifica-se que apenas a variável concentração de íons cálcio (x₃) não foi estatisticamente significativa num nível de 95% de confiança (p=0.88). Tanto o efeito da variável x₁ como x₂ apresentaram valores similares (5,85 e 7,45) e significativos ao nível de 99% de confiança, sendo selecionados para estimativa do modelo matemático que descreve o processo de hidrólise na região experimental estudada.

           

Tabela 4. Estimativas dos efeitos, erros padrão e teste t de Student´s para a porcentagem de  hidrólise do efluente, de acordo com o planejamento fatorial completo 2 ³.

Variáveis	Efeitos	Erro-padrão	Valores de t	Valores de p
Média	13,86	± 0,54	25,63
Enzima (x1)	5,85	± 1,27*	4,61*	0,001*
Goma (x2)	7,45	± 1,27*	5,87*	0,004*
CaCl2 (x3)	-0,20	± 1,27	-0,16	0,88
x1x2	0,25	± 1,27	0,19	0,85
x1x3	-1,00	± 1,27	-0,79	0,47
x2x3	3,00	± 1,27	2,36	0,08

*p< 0,01

Os efeitos principais foram ajustados por análise de regressão múltipla para um modelo linear e a melhor função linearizada, pode ser demonstrada pela equação 2.

y = 14,22 + 2,92 x₁ + 3,73 x₂       (2)

onde: y é a variável resposta, x₁ e x₂ representam os valores codificados para concentração de enzima e concentração de agente emulsificante.

A significância estatística do modelo matemático foi avaliada pelo teste F (Tabela 5), demonstrando que a regressão é altamente significativa a 99% de nível de confiança e apresenta um bom coeficiente de determinação (R²=0,94), deste modo, justificando 94% a variação total da resposta. Segundo Barros Neto et al. (1995), para a regressão não ser apenas estatisticamente significativa, mas também útil para fins preditivos, o valor de F calculado deve ser no mínimo 4 vezes maior que o F tabelado. Desta forma, o modelo estatístico determinado para a porcentagem de hidrólise foi também preditivo.

Tabela 5. Análise de Variância para o modelo fatorial selecionado  

Efeitos	Soma quadrática	Graus de liberdade	Média quadrática	F	p
Modelo	179,45	2	89,73	21,48	0,0010
Curvatura	3,83	1	3,83	0,92	0,37
Resíduos	29,25	7	4,18
Falta de ajuste	24,13	5	4,83	1,88	0,38
Erro Puro	5,12	2	2,56
Total	212,53	10

3.2. Ajuste do pH com bicarbonato de sódio e hidróxido de sódio

            Empregando as condições estabelecidas anteriormente foi verificada a influência da substituição da solução tampão de fosfato de sódio por soluções de bicarbonato de sódio e hidróxido de sódio para ajustar o pH do meio para 7,0. Na presença de bicarbonato de sódio ou hidróxido de sódio observou-se um aumento na porcentagem de hidrólise estimado em torno de 35%, caracterizado pela formação de ácidos graxos e glicerol, conforme mostrado na Tabela 6.

Tabela 6: Parâmetros de caracterização do efluente tratado com Candida rugosa

Ajuste de pH	Glicerol (%)		Ácidos Graxos  (mM/mL)		Demanda Química de Oxigênio (mg/L)
	0 h	12 h	0 h	12 h	0 h	12 h
Tampão	0,34	0,50	0,25	0,41	-	-
NaHCO3	0,18	0,28	0,06	0,68	20914	21857
NaOH	0,25	0,35	0,10	0,65	22557	26646

Não foi verificada redução da matéria orgânica em termos de DQO. De fato, houve um pequeno aumento da DQO em 15% após a hidrólise enzimática, provavelmente devido ao teor de lipídeos no efluente tratado (48,30 g/L). Esses resultados são similares aos descritos por Jung et al. (2002), nos tratamentos efetuados em efluentes contendo teores de gorduras da ordem de 800 mg/L. Apesar disso, o tratamento enzimático foi bastante satisfatório, promovendo a hidrólise parcial dos lipídeos presentes no efluente. 

           

4. CONCLUSÕES

            Neste trabalho foi verificado o efeito de diferentes condições operacionais na porcentagem de hidrólise dos lipídeos presentes no efluente de abate de frangos. O monitoramento da hidrólise foi realizado por meio da quantificação dos ácidos graxos livres em função do tempo de reação. O uso do planejamento fatorial mostrou ser uma ferramenta importante para otimizar as condições de hidrólise desse efluente pela lipase de Candida rugosa. De acordo com o modelo matemático proposto, porcentagens de hidrólises mais elevadas (20,87%), podem ser obtidas empregando uma concentração de enzima de 0,4% (m/v) em presença de agente emulsificante (3% m/v). A substituição da solução do tampão fosfato por solução de NaHCO₃ ou NaOH, elevou o grau de hidrólise para 35%.